Attune^®NxT声波聚焦流式细胞仪采用了模块设计，能够配置至多4种激光和14色荧光检测，适用于多参数分析 (图1)，可满足大多数实验设计和实验室预算要求。Attune^® NxT流式细胞仪能够兼容流式细胞仪中最常用的荧光基团和荧光蛋白，可以与您目前运行的检测板匹配 (表1)。采用可选的561 nm激光还可检测多种荧光蛋白 (图2)。



图1. 采用Attune^®NxT声波聚焦流式细胞仪对小鼠调节性T细胞和树突状细胞进行多参数 (10色) 分析。 采用FSC/SSC参数 (A，左) 对淋巴细胞设门，在后续分析中除去表达B220的B细胞 (A，中)。在B220–、CD45.2+设门范围内，根据CD3表达水平分析T细胞 (A，右)。根据辅助受体CD4或CD8 (B，左) 的表达水平将CD3+ T细胞分成两个群体。在CD4+ T细胞中，有一种抑制性调节性T细胞亚群可以表达转录因子Foxp3和细胞表面标记物CD25 (IL-2Rα) (B，右)。.CD3–细胞中有少量CD11c+ MHCII+群体，它们是专业的抗原提呈树突状细胞(C，左)。脾脏树突状细胞可以进一步分为CD11b+和CD8+树突状细胞亚群 (C，右)，分别具有不同的抗原提呈特性。

图2. 活细胞荧光蛋白检测。 采用CellLight®细胞核-GFP (货号：C10602) 和CellLight®质膜-RFP (货号：C10608) 同时转导U-2 OS细胞。采用Attune®NxT声波聚焦流式细胞仪分析细胞，仪器使用488 nm激光和530/30发射滤光片及561 nm激光和585/16 nm发射滤光片。

表1. Attune^® NxT声波聚焦流式细胞仪荧光基团选择指南。

*不包括适用于PE的黄色激光 (590/40)。
**可以任选各色激光进行侧向散射分析(默认为蓝色激光)。紫色激光侧向散射推荐用于无洗脱/裂解应用。

Attune^®NxT声波聚焦流式细胞仪可以在您需要时提供更高的灵敏度。即便是在1,000 μL/分钟的高进样速率下，您也可以维持精确的聚焦。声波聚焦提供的精确聚焦使研究人员能够获得更小的CV值，更好地鉴别模糊信号和背景，从而减少差异，改善信号分离效果 (图3)。

图3. 不同流速下的灵敏度检测。在(A) 高端的传统流式细胞仪和(B和C) Attune®NxT声波聚焦细胞分析仪上，采用561 nm激光和(A) 610/20或(B和C) 610/15发射滤光片，运行荧光微球 (Spherotech Rainbow校准微粒，3.2 μm)。传统流式细胞仪是在最高的灵敏度设置下运行 (~12.5 μL/分钟)。Attune® NxT流式细胞仪采用了2种不同的设置运行：(B) 12.5 μL/分钟，与传统流式细胞仪相同，以及 (C) 500 μL/分钟，进样量高40x。即便是在最高流速下，Attune® NxT流式细胞仪亦可提供相当或更佳的结果。

细胞周期分析是必须精确检测多个细胞群体之间的荧光强度差异的实例之一。采用Attune^®NxT声波聚焦流式细胞仪，不论样本进样速率如何变化，都可以最大程度地减小结果的差异。您无需再通过放弃通量而获得灵敏度 (图4)。

图4. 采用Attune®NxT声波聚焦流式细胞仪，可在高进样速率下最大程度地减小数据差异。 对Jurkat细胞进行固定，RNA酶处理，并用碘化丙啶（PI）染色，制成浓度为1 x 106个细胞/mL的溶液，以不同的进样速率在Attune® NxT声波聚焦流式细胞仪上进行分析。所有图上左侧的峰反映G0/G1期的细胞，右侧的峰反映G2/M期的细胞。不论进样速率如何，Attune® NxT流式细胞仪上G0/G1和G2/M峰的宽度以及CV%都很稳定，即便是在1,000 μL/分钟的最高进样速率下也是如此。

少量细胞群体的分析需要多次采集才能获得准确且值得信赖的结果，这导致其采集时间较长。Attune^® NxT声波聚焦流式细胞仪的样本运行速率比其他流式细胞仪快10倍——达1,000 μL/分钟，每次运行能采集2 x 10⁷次，可以快速且准确地检测稀有细胞，且不影响数据质量 (图5)。

图5. >100万活细胞的采集和少量 (0.2%) 树突状细胞群的检测。浆细胞样树突状细胞 (pDCs) 是一种特殊的细胞群，它们在病毒的刺激下可产生大量的I型干扰素，可根据免疫表型CD19–/B220高/CD317+进行鉴定。利用CD19-Pacific Blue™、CD317-Alexa Fluor® 488、CD45R/B220-PE直标抗体以及SYTOX® AADvanced™ 死细胞染料对小鼠脾细胞进行四色染色。采用SYTOX®AADvanced™ 死细胞染料在活细胞中设门，然后在CD19–细胞中设门。采用CD45R/B220与CD317双参数曲线鉴定pDC。利用500 μL/分钟的采集速度，获得130万个总细胞，细胞浓度为7.5 x 107个细胞/mL。浆细胞样树突状细胞被鉴定为双B220+/CD317+ (右上象限)，占CD19–活细胞的0.851%，全部脾细胞的0.194%。

洗脱并裂解红细胞 (RBC) 会造成严重的细胞损失和损伤。极高的样本采集速率使得Attune^® NxT流式细胞仪能够提供无需洗脱/裂解的实验方案，最大程度地避免了细胞损失，简化了样本制备 (图6)。该特性尤其适用于那些浓度较低的样本，诸如脑脊液 (CSF)、干细胞及细胞数量较少的稀释样本，这些样品分析的采集时间通常较长。采用Attune^® NxT流式细胞仪，即便是稀释样本，亦可快速采集，且不影响数据质量。可以对诸如小鼠血液和骨髓等难以采集的样本、细针抽吸样本或低细胞产量的样本直接进行荧光标记然后稀释进样，无需洗脱或进行红细胞裂解。在高样本采集速率下可轻松实现采集——您可在四分钟内运行至多4 mL样本。这种样本制备过程不会出现样本损失，且可对所有珍贵样本进行全面检测。



图6. 无需样本制备，且不影响数据质量。采用抗体染色五微升全血，孵育，并使用4 mL缓冲液进行稀释，在Attune^®NxT流式细胞仪上分析。红细胞可以吸收405 nm光线，可实现如中图所示的侧向散射的差异化设门，在该图中，采用405 nm与488 nm侧向散射双参数曲线区分白细胞和红细胞群体。在该群体中，可采用前向散射与侧向散射子曲线图鉴别淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体，无需荧光标示。

Attune^®NxT软件采用直观且易于使用的界面，能提供强大的数据采集和分析功能 (图7)。您可以方便地建立、自定义并保存实验供将来研究之用。自动进行补偿，并可根据补偿指南进行设置。

分析软件为数据分析效率最大化设计，其对较大的数据组的刷新速度快 (高达2,000万次/样本)，当您作出调整时，能够立即显示于数据曲线上。软件采用独特的工具简化了实验设置，包括利用滤光片配置管理器进行试剂选择。您可以从预置或定制试剂下拉菜单中选择试剂，根据仪器上的优化通道匹配适当的试剂，然后应用于曲线标志。

图7. Attune^® NxT软件界面。