TILL 钙离子成像系统

概述

        钙离子是生命活动最重要的离子之一，通过测定细胞内游离钙离子浓度，科研工作者可以得知肌肉收缩、神经信号传导、细胞间通讯、激素反应等生命活动的重要信息。目前世界上胞内钙离子的主流测量方法分为电测量法和光测量法。电测量法利用细胞膜片钳技术测定钙电流引起的细胞膜电位的变化。光测量法利用能与钙离子特异性结合的荧光探针来测定细胞荧光强度的变化。而更为准确和先进的方法则是光电联合测量法，这两者相互印证、相互辅助，可以得出离子浓度变化的准确信息。光电联合测量法利用标准溶液来制作标准曲线，甚至可以测量出胞内钙离子的绝对浓度，是目前世界上测量胞内游离钙离子浓度最为权威的方法之一！

        单细胞膜片钳测定系统和离子荧光比例测量系统是两套既互相独立又协同工作的系统。细胞膜片钳系统用于测定特定生物反应和生命活动时膜电位的变化，离子荧光比例测量系统用于测量细胞钙离子浓度的变化及其绝对值。

实验原理

        目前最常用的Fura-2是一种钙离子荧光指示剂，可与胞内游离钙离子特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发，即：结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的Fura-2激发波长为380nm。因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率，就可以确定结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的比例，进而利用Grynkiewicz公式求出游离钙离子的浓度。

        Grynkiewicz公式：[Ca2+]i＝Kd×β（R-Rmin）×（Rmax-R）。其中，Kd为Fura-2和钙离子结合的平衡解离常数，β是胞内零钙和饱和钙时在380nm的荧光强度比值，R是Ratio比值，Rmin是零钙时Ratio值，Rmax是饱和钙时的Ratio值。Fura-2法可用于测定组织块、器官、人工培养的单层贴壁细胞、血小板等多种细胞的胞内游离钙，此检测方法定量，具有快速、灵敏等优点。

系统扩展

       利用不同的荧光指示剂对不同离子进行染色以后,再利用专业的荧光光源进行激发。该系统可以扩展到测量K、Na、Mg、Cl、H等多种离子的浓度变化。

        如果在该系统中增加一套Dual-View多波长分光器，并配合相应的滤色片，即可将两种不同的发射光一分为二，从而可同时得到同一样本的双波长图象。这样一来就扩展成为一套FRET荧光共振能量转移研究系统。可以方便、精确地进行CFP/YFP、GFP/RFP等的FRET测量，也能完成Fluo3、FluoRed同时装载测定。更是Ind-1测量的最佳选择。

1. 德国TILL公司快速离子浓度测量系统TILL PhotoMetry

主要应用：

• 独立运行的各种离子（Ca2+，Cl-，Na+，pH）的荧光比值测量以及单波长荧光测量。
• 和电生理系统联合运行的各种离子（Ca2+，Cl-，Na+，pH）的荧光比值测量以及单波长荧光测量。
• 快速的FRET测量。

主要特点：

        与Polychromel5单色光源结合使用的快速数据采集。通过Viewfinder方便实现探测区域并改善信噪比。采用特别设计的高增益混合放大电路和优化的电路，可得到优异的灵敏度好低噪音性能。

Polychrome 5 monochromator

• 可快速选择输出波长的光源
• 更明亮稳定的输出。
• 在320nm-650nm范围内，任意波长可在2ms内切换到位。

视野取景框/光电探测器（Viewfinder/Detectors）

• 通过直接的可视影响直接调整检测范围的大小和位置。
• 荧光测量和红光可视影像同时获取。
• 采用固态光电探测技术可获得高达97%的量子效率。
• 可选用光电管或者光电倍增管探头。
• 单路或者双路发射配置，用户可定制滤片组。
• 信号调理部分包括增益、偏置、积分等功能。
• 可和所有主流显微镜匹配。

PhotoMetry控制器

• 荧光数据采样频率可高达1Khz。
• 可通过不同的通路获取两个激发波长的积分数据。
• 基于微处理的控制单元可实现精确的采集。
• 可通过RS-232命令或TTL脉冲执行波长切换协议。
• 可与HEKA/Axon等电生理设备同步采集实现光电联合检测。

2、德国TILL公司离子影像系统TILL PhotoImage

        TILL离子影像系统基于德国TILL公司的快速扫描单色光源，灵活集成了主流的CCD相机/显微镜和各种外设的高端荧光显微镜系统。

主要应用：

        独立运行的各种离子（Ca2+，Cl-，Na+，pH）的荧光比值测量以及单波长荧光测量。

和电生理系统联合运行的各种离子（Ca2+，Cl-，Na+，pH）的荧光比值测量以及单波长荧光测量。

快速的FRET测量。

主要特点：

• 市场上唯一的真正实时影像系统，可以相机的最大速度获取无间隔的采集图像，进行适当的相机设置，可以获得高达100帧*2/每秒的比值影像。
• 常规的电脑操作系统不支持实时操作，Till影像系统采用了外部的数字处理器，以实时方式控制外部的硬件设备，以毫秒精度同步他们的动作。这不仅保证了高速的数据输出，同时由于把照射精确限制在相机的曝光时间段内，因而使对样品的光损伤被最小化。支持市场上主流高端CCD相机。TILL影像系统的核心，Polychromel5，提供了卓越的亮度和均匀特性，这是一种快速的扫描单色光源，可以输出320-680nm范围内任意波长。
• TILlvisION影像软件集成了对外部设备的控制，包括各种XYZ平台、发射滤镜轮、快门、激光传送单元等，特别适合与电生理系统进行同步记录。通过ProtocollEditor把这些特性结合在一起，可形成复杂的试验Protocol，内建的Macro解释器可提供有关试验的进一步特性设置。
• TILL影像系统可以和Till的UV闪光单元组成光解笼锁化合物测量系统。和TILL的红外照明系统组成相差投射光照明系统，或者和TILL的Yanus-2激光扫描器组成FRAP应用和光镊应用。
• TILLvislTRAC软件扩展模块可进行自动粒子跟踪，可视化和粒子运动轨迹的多维定量时域分析
• TILLvis5D和TILLvisDECO分别是硬件和软件扩展模块，可进行快速多维反卷积应用。

TILL visION（标准版）软件主要功能：

• 支持8-bit、16-bit、24-bit和48-bit图像显示和处理功能。文件的显示和处理功能。
• 超过20种形态学筛选功能，包括erode、dilate、watershed、segmentation等。
• 图像和stack文件的数学运算操作。快速傅里叶变换/阴影校正和背景扣除。
• 基本滤镜功能包括：锐化、低通、钝化、中值滤波和消除阴影等。
• 2D去卷积（最近邻点法和非邻点法）和3D重建。
• 时间序列的影像截取。/光谱影像扫描截取。
• Z轴序列影像截取（Z轴马达驱动）。
• 形态学和距离测量。感兴趣微小区域选择工具。
• 图像柱状图。数据的记录和导出。
• 通过ProtocolEditor功能设定实现自动化操作。
• 以长方形、椭圆形及手绘方式无限制地指定测量对象区域。
• 测量指定区域内的平均强度、面积、比例和定标。
• 重新计算每个取得图像的测量值，在图像上显示图表中的时间变化。
• 直接将数据输出到MicrosoftlExcel等表格计算软件中。
• 修正已经设定的测量对象区域整个位置。
• 内置系统校正能够直接显示pH值或者钙离子浓度。
• 在测量及保存后的数据中都可以进行校正。
• 所有的试验数据都能够保存在硬件和外部媒体中，包括图像、事件标记、数据记录、测量范围、校正图像、协议等。
• 图像能够以LZW指定压缩比率，以TILL形式保存。
• 显示使用已经取得事件4的动画，或者保存AVI形式的动画文件。
• 取得图像能够用单色、伪彩色或者定制的LUT（指定波长值等）显示。
• 比列图像能够用单色、伪彩色或者IMD（加强荧光强度后，计算，显示比值）显示。
• 配合TTL触发器的输入，能够启动特定的日志（容易与外部设备联动）。

系统主要构成：

• 科研级高灵敏致冷CCD：为离子成像系统的最主要部件。它的灵敏度高低，信噪比大小直接影响到实验的结果。目前主要可采用的CCD为美国Roper公司生产的CoolSNAP系列，德国PCO公司的QE系列。
• 超快波长切换装置：单色光源系统，快速波长切换装置为荧光指示剂提供激发光源，并能使激发光在不同波长之间快速切换，目前主要采用的德国TILL公司的PolychromeV，美国Sutter公司Lambda DG-4系列等
• 分析软件：带有CCD、光源等周边设备软件控制模块，2、8、16、24、48位图像显示与处理功能模块，2D反卷集、3D构建、多种形态学参数及距离测量模块。同时还具有荧光强度比例成像的数据采集与处理功能。目前常用的软件有德国Till公司的TILLvision；美国UIC公司的MetaMorph/Fluor；其他公司的ExVison、ERPV、Clmage等。
• 滤光片组：根据所选测量的不同离子选择相应的荧光染剂，然后根据所选染剂的特性选择相应的滤光片组，以获取我们所需的激发光源。目前普遍采用美国的Chroma公司的产品。
•  研究级荧光显微镜：可选用各大著名公司的荧光显微镜。